Д. С. Зеленський1, В. М. Бондар, О. І. Жуковский, В. І. Поляков, А. І Соловйов
ДУ «Інститут фармакології та токсикології НАМН України»,
Міжнародний благодійний фонд «Київська Русь», м. Київ
Вплив діізопропілфосфат-олігоетиленгліколя таурохолевої кислоти
на скорочення ізольованих фрагментів аорти щурів
та внутрішньоклітинну концентрацію Ca2+
Дослідження полягало у вивченні внутрішньоклітинних механізмів дії діізопропілфосфат-олігоетиленгліколя таурохолевої кислоти (ДПОГТК), основної діючої речовини лабораторного зразка геропротекторного препарату «ОРІОН» [1]. Вплив цієї речовини на функціональний стан ефекторних елементів серцево-судинної системи не відомий. Це є серйозною прогалиною в доклінічному вивченні препарату, тому що саме хронічні захворювання серцево-судинної системи є основним чинником зменшення тривалості життя.
Особливий інтерес до жирних кислот (ЖК), представником яких є ДПОГТК, пов’язаний з дослідженнями останніх років, що показали наявність специфічних ядерних рецепторів BAR (bile acid receptor) відомих під назвою FXR або NR1H4 [2]. З функціональної точки зору існують дані, що активація цих рецепторів у гладеньком’язових клітинах (ГМК) може індукувати апоптоз клітин шляхом експресії цільових генів FXR – SHP (small heterodimeric partner) та PLTP (phospholipids transfer protein) [3]. Окрім того, відомі дані щодо релаксуючого ефекту таурохолату натрію на гладенькі м’язи (ГМ) [4, 5].
У дослідженнях 2008 року [6] було також показано, що FXR відіграють безпосередню роль у регуляції тонусу судин за рахунок активації промотора ендотеліальної NO-синтази, що призводить до посилення синтезу NO в ендотеліальних клітинах судин.
Крім ядерних рецепторів, ідентифіковані рецептори плазматичної мембрани – серпентини (рецептори, супряжені з G-білком), що взаємодіють з ЖК [6] (TGR5/Gbar1). Дія ЖК на клітини призводить до експресії цих рецепторів, синтезу цАМФ, активації МАР-кіназного сигнального шляху та інтерналізації останніх [7].
Останні дослідження [8] демонструють важливу роль ЖК у внутрішньоклітинній регуляції обміну жирів, вуглеводів, активації рецепторів, сполучених з G-білками. У той самий час відсутні дані щодо впливу ДПОГТК на тонус судин та Ca2+-транзієнти в ГМК.
Мета дослідження – вивчення змін внутрішньоклітинної концентрації Са2+ та скоротливої активності кровоносних судин під впливом ДПОГТК.
Відомо, що скоротлива активність ГМК регулюється внутрішньоклітинним кальцієм. Тому досліджували взаємозв’язок між індукованими ДПОГТК змінами тонусу та концентрацією внутрішньоклітинного кальцію ([Са2+]і) у судинній стінці. У з’ясуваннi клітинних механізмів дії препарату «ОРІОН» є важлим дослiдження взаємозв’язку індукованих змін тонусу ГМК та концентрації [Са2+]і.
Матеріали та методи. Для дослідів були використані сегменти грудного відділу аорти дорослих щурів-самців лінії Вістар-Кіото масою (210 ± 30) г. Усі процедури зі щурами проводили з використанням рекомендацій Європейської конвенції щодо захисту тварин, що використовуються в експериментальних та інших цілях. Судини зовні ретельно вичищали від сполучної тканини та розрізали на кільця завширшки близько 2 мм. Усі процедури з судинами проводили за кімнатної температури в розчині Кребса, що мав наступний склад (ммоль/л): NaCl 122, KCl 4,7, NaHCO3 15,5, KH2PO4 1,2, CaCl2 2,5, MgCl2 1,2 та глюкоза 11,5, pH 7,3-7,4. Досліди проводили з інтактними та деендотелізованими кільцями судин. Після препарування сегменти судин вивертали шаром ендотелію назовні. У разі необхідності з них видаляли шар ендотелію механічним способом за допомогою фільтрувального паперу. Належне видалення ендотелію перевіряли під мікроскопом та за відсутністю реакції на ацетилхолін. Аналізували одночасні зміни [Ca2+]i та вазорелаксаційного відгуку, що виникають у ГМ, попередньо скорочених деполяризуючим гіперкалієвим розчином К+ (60 ммоль/л) або активацією адренорецепторів ГМ фенілефрином (10–6 моль/л).
Досліди виконували в камері об’ємом 300 мкл, установленій на предметний стіл флуоресцентного мікроскопа ЛЮМАМ-И2 (С.-Петербург, Росія), що входить до складу експериментальної установки [9–12]. Уміст [Са2+]і вимірювали з використанням флуоресцентного кальцієвого індикатора Fura-2 [13]. Завантажування барвником кілець аорти здійснювали при кімнатній температурі в захищеному від світла місці впродовж 4 год. Сегменти судин поміщали в завантажувальний розчин наступного складу: Fura-2AM 10 мкмоль/л; DMSO 2,5 % (за об’ємом); Pluronic F-127 0,5 % (за масою); розчин Кребса 95 % (за об’ємом) рН – 7,35. Після завантаження всі зразки сегментів судин переносили у ванночку з розчином Кребсу, де вони залишались протягом не менше 30 хв. Препарат судин фіксували на гачках датчика скорочень у робочій камері за температури розчину 36 °С під навантаженням (10–15) мН. Під час експерименту всі розчини подавали до камери зі швидкістю 1 мл/хв (перистальтичний насос Masterflex). Результати вимірювань [Ca2+]i представлені як відношення (R = I340nm /I380nm) інтенсивності флуоресцентних сигналів (I) при 340 та 380 нм, за вирахуванням значення фонової флуоресценції згідно з методикою [9, 14, 15]. Для цього наприкінці експерименту для гасіння флуоресценції барвника застосовували розчин Кребса з Mn2+ (20 ммоль/л).
Усі неорганічні сполуки одержували від Sigma Chemical Co. (США), Fura-2 AM – від Molecular Probes, Inc. (США).
Усі дані наведено у вигляді середнього арифметичного ± помилка середнього арифметичного. Порівняння отриманих величин проводили за методом Стьюдента для непарних вимірів. Розходження вважали статистично достовірними, якщо величина р була менше 0,05. Усі статистичні розрахунки проводили на персональному комп’ютері з використанням програм OriginPro 7.0.
Результати та їх обговорення. Для дослідження взаємозв’язку кальцієвого метаболізму та скоротливої активності ГМК під впливом ДПОГТК (у концентраціях від 10–4 до 10–6 моль/л) одночасно вимірювали силу скорочення та [Са2+]i. Відомо, що скорочення ГМ за фізіологічних умов розвивається за рахунок дії фізичних (тиск, температура) факторів і\або зв’язування екзо- та ендогенних речовин з їхніми специфічними рецепторами, що в результаті призводить до збільшення [Са2+]i та ініціації скорочення. Сила скорочення ГМ за умов in vitro залежить від базального стану та шляхів попередньої активації ГМК [16]. Тому принципово було дослідити дію препарату за різних способів активації судин та оцінити вплив ДПОГТК на базальний рівень [Са2+]i та тонус ГМК.
На рисунку 1 наведено оригінальний запис впливу ДПОГТК на базальний тонус сегмента грудного відділу аорти щура та [Са2+]i у ГМК. Додавання ДПОГТК у концентрації 10–4 моль/л призводило до стійкої констрикції на фоні транзиторного збільшення [Са2+]і.
Традиційно вважається, що сила скорочення ГМК має корелювати з величиною [Ca2+]i. У той самий час отримані дані свідчать про те, що ДПОГТК викликала констрикцію ГМ за рахунок підвищення [Ca2+]i лише на першій фазі скорочення.
Рис. 1. Базальний рівень ізометричної напруги та [Ca2+]i у ГМК грудного відділу аорти щура за впливу ДПОГТК у концентрації 10–4 моль/л (оригінальний запис)
Після досягнення максимального значення [Ca2+]i концентрація кальцію починала зменшуватися до вихідного базального значення, у той час як ізометрична напруга ГМ збільшувалася до свого сталого значення (2,7 ± 0,8) мН, n = 5. Це свідчить про збільшення чутливості скоротливого апарату ГМК аорти щурів до іонів кальцію на фоні дії ДПОГТК.
Таким чином, отримані дані дозволяють припустити, що ДПОГТК у концентрації 10–4 моль/л викликає сталу констрикцію ГМК переважно за рахунок підвищення кальцієвої чутливості міофібрил.
Далі, для вивчення дії ДПОГТК на ГМК було використано два шляхи попереднього підвищення [Са2+]i: використовували розчин з високим умістом K+ (60 ммоль/л) та розчин фенілефрину (ФE) (10–6 моль/л).
На рисунку 2 наведено оригінальний запис впливу ДПОГТК на скоротливу активність та [Ca2+]i у ГМК грудного відділу аорти щурів, попередньо скорочених деполяризуючим розчином К+. Середнє значення максимального скорочення у відповідь на дію K+ становило 5,05 ± 0,4 мН.
У концентрації 10–6 моль/л ДПОГТК статистично достовірно не впливала на силу скорочення та [Ca2+]i, однак у концентрації 10–4 моль/л призводила дорелаксації ГМ на 48,6 ± 8,0 % та 66,0 ± 9,1 % у деендотелізованих та інтактних судинах відповідно. При цьому спостерігалося зменшення [Са2+]і на 72 ± 15,1 % (n = 5).
Рис. 2. Скоротлива активність та [Ca2+]i у деендотелізованих ГМК грудного відділуаорти щура за умов попередньої активації деполяризуючим розчином К+ та впливуДПОГТК (оригінальні криві)
Наведені дані дозволяють припустити, що ДПОГТК у концентрації 10–4 моль/л призводила до закриття потенціал-залежних Са-каналів L-типу, що були відкриті внаслідок деполяризації мембрани розчином з високим умістом K+. Цей результат корелює з відомими даними про підвищення концентрації цАМФ у результаті зв’язування ДПОГТК з рецептором TGR5 [17].
На рисунку 3 відображено оригінальний запис скоротливої активності та [Ca2+]i у деендотелізованих ГМК грудного відділу аорти щурів за умов попереднього скорочення ФЕ (10–6 моль/л) та впливу ДПОГТК. Середні значення сили скорочення на ФЕ (10–6 моль/л) становили 6,75 ± 0,6 мН.
У концентрації 10–4 ДПОГТК призводила до релаксації ГМ на 54,5 ± 9,0 % та зменшення [Са2+]і до базального значення (n = 5). Отримані дані свідчать про те, що ДПОГТК, можливо, здатна інгібувати як Са2+-канали L-типу, так і рецепторзв’язані Ca2+-канали. У той самий час ДПОГТК у концентрації 10–6 моль/л не впливала на силу скорочення та [Ca2+]i попередньо скорочених ГМК.
Згідно з сучасними уявленнями, одним із провідних патогенетичних чинників серцево-судинних хвороб вважають порушення функції ендотелію [17, 18]. Ендотелій відіграє провідну роль у підтриманні нормального тонусу судин, забезпеченні локального гомеостазу та проліферації судинної стінки. Порушення балансу між вазодилататорами та вазоконстрикторами є ключовим фактором при ендотеліальній дисфункції [19]. Відомо, що зв’язування FXR з ДПОГТК призводить до активації промотора NO-синтази та відповідного збільшення концентрації NO у клітинах ендотелію судин [4]. Тому важливо було виконати порівняльні дослідження щодо впливу ДПОГТК як на інтактних, так і деендотелізованих судинах.
На рисунку 4 наведено оригінальний запис впливу ДПОГТК на скоротливу активність ГМ, попередньо скорочених ФЕ (10–6 моль/л), та [Ca2+]i в ендотеліальних клітинах грудного відділу аорти щурів. У концентрації 10–4 ДПОГТК призводила до релаксації ГМ на 68,2 ± 7,2 % та збільшення на 15,0 ± 6,6 % загальної концентрації [Са2+]іe (n=5). Таким чином, ДПОГТК викликала ендотелій-залежне розслаблення ГМ інтактних судин грудного відділу аорти щурів, підвищуючи [Ca2+]i в ендотеліальних клітинах, що призводило до вивільнення NO з ендотеліоцитів та вазорелаксації ГМ. Після усунення дії ДПОГТК тонус ГМ повертався до вихідного значення.
Рис. 3. Рівень ізометричної напруги та [Ca2+]i у ГМК сегмента грудного відділу аорти щура за умов попереднього скорочення фенілефрином у концентрації 10–6 моль/л та впливу ДПОГТК у концентрації 10–4 моль/л
Рис. 4. Ізометрична напруга судин та [Ca2+]i у ендотелії (фокусування на ендотелії) грудного відділу аорти щура за умов попереднього скорочення фенілефрином та впливу ДПОГТК у концентрації 10–4 моль/л
Висновки
1. У концентрації 10–4 моль/л ДПОГТК (діюча речовина препарату «ОРІОН») викликала констрикцію неактивованих ГМ. Констрикція неактивованих ГМ під дією ДПОГТК розвивалася на фоні підвищення кальцієвої чутливості міофібрил. У концентрації 10–6 моль/л ДПОГТК статистично достовірно не впливала на скоротливу активність ГМ та [Ca2+]i неактивованих ГМ.
2. Ступінь вазодилатації судин щурів, попередньо активованих розчином з високим вмістом К+ (60 ммоль/л), складав 48,6 ± 8,0 % та 54,5 ± 9,0 % для активованих розчином ФЕ (10–6 моль/л). Розслаблення ГМК супроводжувалося зменшенням [Ca2+]i до базального рівня (n = 5).
3. У концентрації 10–4 моль/л ДПОГТК впливав на функцію ендотеліоцитів: підвищував рівень [Ca2+]i в ендотелії та викликав ендотелій-залежне розслаблення.