Стаття “Вплив таурохолевої кислоти на скорочення аорти щурів та концентрацію Ca2+…”

Д. С. Зеленський1, В. М. Бондар, О. І. Жуковский, В. І. Поляков, А. І Соловйов

ДУ «Інститут фармакології та токсикології НАМН України»,

                                                                         Міжнародний благодійний фонд «Київська Русь», м. Київ                                                                                                                                         

Вплив діізопропілфосфат-олігоетиленгліколя таурохолевої кислоти

на скорочення ізольованих фрагментів аорти щурів

та внутрішньоклітинну концентрацію Ca2+ 

Дослідження полягало у вивченні внутрішньоклітинних механізмів дії діізопропілфосфат-олігоетиленгліколя таурохолевої кислоти (ДПОГТК), основної діючої речовини лабораторного зразка геропротекторного препарату «ОРІОН» [1]. Вплив цієї речовини на функціональний стан ефекторних еле­ментів серцево-судинної системи не відомий. Це є серйозною прогалиною в доклінічному вивченні препарату, тому що саме хронічні захворювання серце­во-судинної системи є основним чинни­ком зменшення тривалості життя.

Особливий інтерес до жирних кис­лот (ЖК), представником яких є ДПОГТК, пов’язаний з дослідження­ми останніх років, що показали наяв­ність специфічних ядерних рецепторів BAR (bile acid receptor) відомих під назвою FXR або NR1H4 [2]. З функціональної точки зору існують дані, що активація цих рецепторів у гладеньком’язових клітинах (ГМК) може інду­кувати апоптоз клітин шляхом екс­пресії цільових генів FXR – SHP (small heterodimeric partner) та PLTP (phospholipids transfer protein) [3]. Окрім того, відомі дані щодо релаксуючого ефекту таурохолату натрію на гладенькі м’язи (ГМ) [4, 5].

У дослідженнях 2008 року [6] було також показано, що FXR відіграють безпосередню роль у регуляції тонусу судин за рахунок активації промотора ендотеліальної NO-синтази, що призво­дить до посилення синтезу NO в ендоте­ліальних клітинах судин.

Крім ядерних рецепторів, ідентифі­ковані рецептори плазматичної мембра­ни – серпентини (рецептори, супряжені з G-білком), що взаємодіють з ЖК [6] (TGR5/Gbar1). Дія ЖК на клітини при­зводить до експресії цих рецепторів, синтезу цАМФ, активації МАР-кіназного сигнального шляху та інтер­налізації останніх [7].

Останні дослідження [8] демон­струють важливу роль ЖК у вну­трішньоклітинній регуляції обміну жирів, вуглеводів, активації рецепто­рів, сполучених з G-білками. У той самий час відсутні дані щодо впливу ДПОГТК на тонус судин та Ca2+-транзієнти в ГМК.

Мета дослідження – вивчення змін внутрішньоклітинної концентрації Са2+ та скоротливої активності кровоносних судин під впливом ДПОГТК.

Відомо, що скоротлива активність ГМК регулюється внутрішньоклітин­ним кальцієм. Тому досліджували взаємозв’язок між індукованими ДПОГТК змінами тонусу та концентра­цією внутрішньоклітинного кальцію ([Са2+]і) у судинній стінці. У з’ясуваннi клітинних механізмів дії препарату «ОРІОН» є важлим дослiдження взаємозв’язку індукованих змін тонусу ГМК та концентрації [Са2+]і.

Матеріали та методи. Для дослідів були використані сегменти грудного відділу аорти дорослих щурів-самців лінії Вістар-Кіото масою (210 ± 30) г. Усі процедури зі щурами проводили з використанням рекомендацій Європей­ської конвенції щодо захисту тварин, що використовуються в експеримен­тальних та інших цілях. Судини зовні ретельно вичищали від сполучної тка­нини та розрізали на кільця завширш­ки близько 2 мм. Усі процедури з судинами проводили за кімнатної тем­ператури в розчині Кребса, що мав наступний склад (ммоль/л): NaCl 122, KCl 4,7, NaHCO3 15,5, KH2PO4 1,2, CaCl2 2,5, MgCl2 1,2 та глюкоза 11,5, pH 7,3-7,4. Досліди проводили з інтактними та деендотелізованими кільцями судин. Після препарування сегменти судин вивертали шаром ендо­телію назовні. У разі необхідності з них видаляли шар ендотелію механіч­ним способом за допомогою фільтру­вального паперу. Належне видалення ендотелію перевіряли під мікроскопом та за відсутністю реакції на ацетилхо­лін. Аналізували одночасні зміни [Ca2+]i та вазорелаксаційного відгуку, що виникають у ГМ, попередньо ско­рочених деполяризуючим гіперкаліє­вим розчином К+ (60 ммоль/л) або активацією адренорецепторів ГМ фені­лефрином (10–6 моль/л).

Досліди виконували в камері об’ємом 300 мкл, установленій на предметний стіл флуоресцентного мікроскопа ЛЮМАМ-И2 (С.-Петербург, Росія), що входить до складу експериментальної установки [9–12]. Уміст [Са2+]і вимі­рювали з використанням флуоресцент­ного кальцієвого індикатора Fura-2 [13]. Завантажування барвником кілець аорти здійснювали при кімнат­ній температурі в захищеному від світ­ла місці впродовж 4 год. Сегменти судин поміщали в завантажувальний розчин наступного складу: Fura-2AM 10 мкмоль/л; DMSO 2,5 % (за об’ємом); Pluronic F-127 0,5 % (за масою); роз­чин Кребса 95 % (за об’ємом) рН – 7,35. Після завантаження всі зразки сегментів судин переносили у ванночку з розчином Кребсу, де вони залиша­лись протягом не менше 30 хв. Препа­рат судин фіксували на гачках датчика скорочень у робочій камері за темпера­тури розчину 36 °С під навантаженням (10–15) мН. Під час експерименту всі розчини подавали до камери зі швид­кістю 1 мл/хв (перистальтичний насос Masterflex). Результати вимірювань [Ca2+]i представлені як відношення (R = I340nm /I380nm) інтенсивності флуо­ресцентних сигналів (I) при 340 та 380 нм, за вирахуванням значення фонової флуоресценції згідно з методи­кою [9, 14, 15]. Для цього наприкінці експерименту для гасіння флуоресцен­ції барвника застосовували розчин Кребса з Mn2+ (20 ммоль/л).

Усі неорганічні сполуки одержували від Sigma Chemical Co. (США), Fura-2 AM – від Molecular Probes, Inc. (США).

Усі дані наведено у вигляді середньо­го арифметичного ± помилка середньо­го арифметичного. Порівняння отрима­них величин проводили за методом Стьюдента для непарних вимірів. Роз­ходження вважали статистично досто­вірними, якщо величина р була менше 0,05. Усі статистичні розрахунки про­водили на персональному комп’ютері з використанням програм OriginPro 7.0.

Результати та їх обговорення. Для дослідження взаємозв’язку кальцієвого метаболізму та скоротливої активності ГМК під впливом ДПОГТК (у концен­траціях від 10–4 до 10–6 моль/л) одно­часно вимірювали силу скорочення та [Са2+]i. Відомо, що скорочення ГМ за фізіологічних умов розвивається за рахунок дії фізичних (тиск, температу­ра) факторів і\або зв’язування екзо- та ендогенних речовин з їхніми специфіч­ними рецепторами, що в результаті призводить до збільшення [Са2+]i та ініціації скорочення. Сила скорочення ГМ за умов in vitro залежить від базального стану та шляхів попередньої активації ГМК [16]. Тому принци­пово було дослідити дію препарату за різних способів активації судин та оці­нити вплив ДПОГТК на базальний рівень [Са2+]i та тонус ГМК.

На рисунку 1 наведено оригінальний запис впливу ДПОГТК на базальний тонус сегмента грудного відділу аорти щура та [Са2+]i у ГМК. Додавання ДПОГТК у концентрації 10–4 моль/л призводило до стійкої констрикції на фоні транзиторного збільшення [Са2+]і.

Традиційно вважається, що сила скорочення ГМК має корелювати з величиною [Ca2+]i. У той самий час отримані дані свідчать про те, що ДПОГТК викликала констрикцію ГМ за рахунок підвищення [Ca2+]i лише на першій фазі скорочення.

Рис. 1. Базальний рівень ізометричної напруги та [Ca2+]i у ГМК грудного відділу аорти щура за впливу ДПОГТК у концентрації 10–4 моль/л (оригінальний запис)

Після досягнення максимального значення [Ca2+]i концентрація кальцію почина­ла зменшуватися до вихідного базаль­ного значення, у той час як ізометрич­на напруга ГМ збільшувалася до свого сталого значення (2,7 ± 0,8) мН, n = 5. Це свідчить про збільшення чутли­вості скоротливого апарату ГМК аорти щурів до іонів кальцію на фоні дії ДПОГТК.

Таким чином, отримані дані дозволя­ють припустити, що ДПОГТК у концен­трації 10–4 моль/л викликає сталу кон­стрикцію ГМК переважно за рахунок підвищення кальцієвої чутливості міо­фібрил.

Далі, для вивчення дії ДПОГТК на ГМК було використано два шляхи попе­реднього підвищення [Са2+]i: викорис­товували розчин з високим умістом K+ (60 ммоль/л) та розчин фенілефрину (ФE) (10–6 моль/л).

На рисунку 2 наведено оригінальний запис впливу ДПОГТК на скоротливу активність та [Ca2+]i у ГМК грудного відділу аорти щурів, попередньо скоро­чених деполяризуючим розчином К+. Середнє значення максимального ско­рочення у відповідь на дію K+ станови­ло 5,05 ± 0,4 мН.

У концентрації 10–6 моль/л ДПОГТК статистично достовірно не впливала на силу скорочення та [Ca2+]i, однак у кон­центрації 10–4 моль/л призводила дорелаксації ГМ на 48,6 ± 8,0 % та 66,0 ± 9,1 % у деендотелізованих та інтактних судинах відповідно. При цьому спостерігалося зменшення [Са2+]і на 72 ± 15,1 % (n = 5).

Рис. 2. Скоротлива активність та [Ca2+]i у деендотелізованих ГМК грудного відділуаорти щура за умов попередньої активації деполяризуючим розчином К+ та впливуДПОГТК (оригінальні криві)

Наведені дані дозволяють припусти­ти, що ДПОГТК у концентрації 10–4 моль/л призводила до закриття потенціал-залежних Са-каналів L-типу, що були відкриті внаслідок деполяри­зації мембрани розчином з високим умістом K+. Цей результат корелює з відомими даними про підвищення кон­центрації цАМФ у результаті зв’язування ДПОГТК з рецептором TGR5 [17].

На рисунку 3 відображено оригіналь­ний запис скоротливої активності та [Ca2+]i у деендотелізованих ГМК груд­ного відділу аорти щурів за умов попе­реднього скорочення ФЕ (10–6 моль/л) та впливу ДПОГТК. Середні значення сили скорочення на ФЕ (10–6 моль/л) становили 6,75 ± 0,6 мН.

У концентрації 10–4 ДПОГТК призво­дила до релаксації ГМ на 54,5 ± 9,0 % та зменшення [Са2+]і до базального значен­ня (n = 5). Отримані дані свідчать про те, що ДПОГТК, можливо, здатна інгібувати як Са2+-канали L-типу, так і рецепторзв’язані Ca2+-канали. У той самий час ДПОГТК у концентрації 10–6 моль/л не впливала на силу скорочення та [Ca2+]i попередньо скорочених ГМК.

Згідно з сучасними уявленнями, одним із провідних патогенетичних чинників серцево-судинних хвороб вва­жають порушення функції ендотелію [17, 18]. Ендотелій відіграє провідну роль у підтриманні нормального тонусу судин, забезпеченні локального гомеос­тазу та проліферації судинної стінки. Порушення балансу між вазодилатато­рами та вазоконстрикторами є ключо­вим фактором при ендотеліальній дис­функції [19]. Відомо, що зв’язування FXR з ДПОГТК призводить до актива­ції промотора NO-синтази та відповід­ного збільшення концентрації NO у клітинах ендотелію судин [4]. Тому важливо було виконати порівняльні дослідження щодо впливу ДПОГТК як на інтактних, так і деендотелізованих судинах.

На рисунку 4 наведено оригінальний запис впливу ДПОГТК на скоротливу активність ГМ, попередньо скорочених ФЕ (10–6 моль/л), та [Ca2+]i в ендотелі­альних клітинах грудного відділу аорти щурів. У концентрації 10–4 ДПОГТК призводила до релаксації ГМ на 68,2 ± 7,2 % та збільшення на 15,0 ± 6,6 % загальної концентрації [Са2+]іe (n=5). Таким чином, ДПОГТК викликала ендотелій-залежне розслаблення ГМ інтактних судин грудного відділу аорти щурів, підвищуючи [Ca2+]i в ендотелі­альних клітинах, що призводило до вивільнення NO з ендотеліоцитів та вазорелаксації ГМ. Після усунення дії ДПОГТК тонус ГМ повертався до вихід­ного значення.

Рис. 3. Рівень ізометричної напруги та [Ca2+]i у ГМК сегмента грудного відділу аорти щура за умов попереднього скорочення фенілефрином у концентрації 10–6 моль/л та впливу ДПОГТК у концентрації 10–4 моль/л

Рис. 4. Ізометрична напруга судин та [Ca2+]i у ендотелії (фокусування на ендотелії) грудного відділу аорти щура за умов попереднього скорочення фенілефрином та впливу ДПОГТК у концентрації 10–4 моль/л

Висновки

1. У концентрації 10–4 моль/л ДПОГТК (діюча речовина препарату «ОРІОН») викликала констрикцію неактивованих ГМ. Констрикція неак­тивованих ГМ під дією ДПОГТК роз­вивалася на фоні підвищення кальціє­вої чутливості міофібрил. У концентрації 10–6 моль/л ДПОГТК статистич­но достовірно не впливала на скорот­ливу активність ГМ та [Ca2+]i неакти­вованих ГМ.

2. Ступінь вазодилатації судин щурів, попередньо активованих розчином з висо­ким вмістом К+ (60 ммоль/л), складав 48,6 ± 8,0 % та 54,5 ± 9,0 % для активо­ваних розчином ФЕ (10–6 моль/л). Розсла­блення ГМК супроводжувалося зменшен­ням [Ca2+]i до базального рівня (n = 5).

3. У концентрації 10–4 моль/л ДПОГТК впливав на функцію ендотеліоцитів: підви­щував рівень [Ca2+]i в ендотелії та викли­кав ендотелій-залежне розслаблення.